چگونه می توان پودر آنزیم بروملین واقعی را از غلط تشخیص داد؟

تقریباً همه شرکت هایی وجود دارند که آن را فروخته اندپودر آنزیم بروملینبا پاپائین مخلوط می شود. خالص سازی بروملین تا 5000GDU/g مشکل است. اما به راحتی می توان پاپائین را تا 1{4}}000GDU/g خالص کرد. حتی تا 2000000GDU/g. اما عملکرد بروملین با پاپائین متفاوت است. رنگ، بو، حلالیت در آب و طعم با محصول تقلبی و محصول واقعی در تضاد است. آنها تفاوت دارند پودر آنزیم بروملین مناسب خاکستری، بی بو، بی مزه و نامحلول در آب است.

اما بروملین کاذب دارای ویژگی های زیر است:

● زرد روشن، معطر و ملایم شیرین و محلول در آب است. این ویژگی پاپائین است.

● برای کاهش التهاب و تسکین درد استفاده می شود. اما تقریباً هیچ این توابع در پاپاین وجود ندارد.

● فقط به عنوان مکمل غذایی استفاده می شود، نه افزودنی غذا، اما در واقع می تواند درجه دارویی باشد. اما پاپائین فقط به عنوان پودر نرم کننده گوشت و مواد آرایشی استفاده می شود.

ما بروملین را بر اساس ژل SDS-PAGE و روش های تجزیه و تحلیل واحد هضم ژلاتین و HPLC آزمایش کردیم، در روش ژل SDS-PAGE مولکول های هدف کمتری برای محصول جعلی وجود دارد.

در زیر نتایج الکتروفورز صفحه SDS آورده شده است

لکه های موجود در بالا نشان می دهد که فقط محصول مناسب همان لکه را در جای مناسب در تصویر دارد، اما محصول تقلبی دارای لکه های کمی روی آن است، یعنی وزن مولکولی به سختی قابل مشاهده است.

وزن مولکولی بروملین حدود 33000 است، اما وزن مولکولی پاپائین 21000 است. و کروماتوگرام HPLC:

خواهید دید که فقط عصاره مناسب حاوی وزن مولکولی مناسب بروملین است و با HPLC قابل تشخیص است.

اما اگر ما فقط با روش تجزیه و تحلیل واحد هضم ژلاتین (GDU) آزمایش کنیم، به پیوست II مراجعه کنید. هر دو محصول درست و نادرست نتایج یکسانی دارند که در زیر آمده است:

ساقه آناناس بسیار ارزان است، و نرخ از ساقه به بروملین بسیار کم است، برخی از آلودگی در فرآیند تولید وجود دارد.

تقریباً تمام کارخانه های پودر آنزیم بروملین در نزدیکی میدان هستند. از ساقه تازه استفاده می کنند. حمل ساقه در مسافت های طولانی غیرممکن است. مواد خام باید در اسرع وقت پس از جمع‌آوری از مزرعه نگهداری شود یا در محیطی با دمای پایین ({0}} درجه) نگهداری شود تا از تخریب پروتئین جلوگیری شود. در زندگی واقعی، تولید کننده در واقع نمی تواند هیچ یک از دو شرط فوق را به دلیل ساقه های زیاد آناناس برآورده کند. روش معقول تعادل بین زمان دست زدن و از دست دادن فعالیت پروتئین است. معمولاً مواد خام خام را در فصل برداشت آناناس تولید می کنند و مواد خام خام را در محیطی با دمای پایین (4-8 درجه) ذخیره می کنند.

ما در حال انجام آزمایشی در مورد الکتروفورز صفحه SDS هستیم، در تئوری می توانیم آن را به 10،000 یا 20،000 برسانیم. اما بسیار گران خواهد بود. 5000GDU/g و پایداری آن را شاید بر روی یک مالت ساپورت / میکرو کپسوله شده یا چیزی بعلاوه استخراج/تصفیه درجه ارگانیک.

پیوست I

● روش 5 الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید SDS (SDS-PAGE)

SDS-PAGE یک روش الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید دناتوره شده است. اصل جداسازی پروتئین در این روش بر این واقعیت استوار است که اکثر پروتئین ها می توانند با سورفکتانت آنیونی سدیم دودسیل سولفات (SDS) در یک نسبت وزنی ترکیب شوند و یک کمپلکس تشکیل دهند.

بار منفی حمل شده توسط مولکول های پروتئین بسیار بیشتر از بار خالص مولکول های پروتئین طبیعی است، که اثر بار مولکول های مختلف پروتئین را از بین می برد و پروتئین ها را بر اساس اندازه مولکولی آنها جدا می کند.

این روش برای شناسایی کیفی، کنترل خلوص و ناخالصی و تعیین کمی پروتئین ها استفاده می شود.

1 دستگاه ابزار

منبع تغذیه ولتاژ ثابت یا جریان ثابت، مخزن الکتروفورز صفحه عمودی و قالب ساخت چسب.

2. معرف ها

(1) آب.

(2) بافر ژل جداسازی (4x، محلول A) 1.5mol/L بافر تری هیدروکسی متیل آمینو متان هیدروکلریک اسید. 18.15 گرم تری هیدروکسی متیل آمینو متان را وزن کرده و با مقدار مناسب آب حل کنید. مقدار pH را با اسید هیدروکلریک روی 88 تنظیم کنید و با آب تا 100 میلی لیتر رقیق کنید.

(3) 58.0 گرم آکریل آمید و 20 گرم N, N'- متیلن بیساکریل آمید در محلول آکریل آمید 30 درصد (محلول B) وزن کنید، در آب گرم حل کنید و تا 200 میلی لیتر رقیق کنید، با کاغذ صافی صاف کنید (ذخیره شده در تاریک).

(4) 10 گرم سدیم دودسیل سولفات را در محلول 10 درصد SDS (محلول C) وزن کنید، در آب حل کنید و تا 100 میلی لیتر رقیق کنید.

(5) معرف تجاری سازی محلول تترا متیل اتیلن دی آمین (محلول TEMED، D).

محلول پرسولفات آمونیوم 10 درصد (محلول E) 10 گرم پرسولفات آمونیوم را وزن کرده، در آب حل کرده و تا 100 میلی لیتر رقیق کنید. توصیه می شود قبل از استفاده آن را تهیه کنید یا به مدت 2 هفته به طور جداگانه در درجه -20 نگهداری کنید.

(7) بافر لاستیکی غلیظ (محلول 4×، F) 0.5mol/L بافر تری هیدروکسی متیل آمینو متان هیدروکلریک اسید، وزن 6.05 گرم تری هیدروکسی متیل آمینو متان، اضافه کردن مقدار مناسب آب برای حل کردن، مقدار pH را با هیدروکلریک روی 6.8 تنظیم کنید. اسید، و با آب تا 100 میلی لیتر رقیق کنید.

(8) بافر الکترود (10×) 30 گرم تری متیل آمینو متان، 144 گرم گلیسین، و 10 گرم سدیم دودسیل سولفات وزن کنید، آنها را در آب حل کرده و تا حدود 800 میلی لیتر رقیق کنید. مقدار pH را با اسید کلریدریک روی 8 تنظیم کنید.{7}}.8 و با آب تا 1000 میلی لیتر رقیق کنید.

(9) بافر نمونه کاهش نیافته (4×) 3 0 3 گرم تری متیل آمینو متان، 20 میلی گرم بروموفنل بلو و 8 گرم سدیم دودسیل سولفات وزن کنید، 40 میلی لیتر گلیسرول را اندازه بگیرید، در آب حل کنید و تا حدود 80 میلی لیتر رقیق کنید. PH را با اسید هیدروکلریک روی 68 تنظیم کنید و با آب تا 100 میلی لیتر رقیق کنید.

(8) بافر الکترود (10×) 30 گرم تری متیل آمینو متان، 144 گرم گلیسین، و 10 گرم سدیم دودسیل سولفات را وزن کنید، در آب حل کنید و تا حدود 800 میلی لیتر رقیق کنید. مقدار DH را با اسید کلریدریک روی 81-88 تنظیم کنید و با آب تا 1000 میلی لیتر رقیق کنید.

(9) بافر نمونه کاهش نیافته (4×) 3.03 گرم تری متیل آمینو متان، 20 میلی گرم بروموفنل بلو و 80 گرم سدیم دودسیل سولفات وزن کنید، 40 میلی لیتر گلیسرول را اندازه بگیرید، در آب حل کنید و تا حدود 80 میلی لیتر رقیق کنید. PH را با اسید هیدروکلریک روی 6.8 تنظیم کنید و با آب تا 100 میلی لیتر رقیق کنید.

(1{16}}) بافر ماده آزمایش کاهش یافته (4×) 3.03 گرم تری متیل آمینو متان، 20 میلی گرم بروموفنول بلو و 80 گرم سدیم دودسیل سولفات وزن کنید، 40 میلی لیتر گلیسرول را اندازه بگیرید، حل کنید و با آب تا حدود 80 میلی لیتر رقیق کنید و اضافه کنید. - 20 میلی‌لیتر مرکاپتواتانول، pH را با اسید کلریدریک روی 6.8 تنظیم کنید، با آب تا 100 میلی‌لیتر رقیق کنید (یا 3.03 گرم تری متیل آمینو متان، 20 میلی‌گرم بروموفنل بلو، 8.0 گرم سدیم دودسیل سولفات، 40 میلی‌لیتر گلیسرول را در آب رقیق کنید، حل کنید. تا 80 میلی لیتر، pH را با اسید کلریدریک روی 6.8 تنظیم کنید، با آب تا 100 میلی لیتر رقیق کنید و قبل از استفاده، دیتیوتریتول را به 100 میلی مول در لیتر اضافه کنید.

● پیوست II

روش تجزیه و تحلیل واحد هضم ژلاتین (GDU)

الف. هدف: از این روش برای تعیین فعالیت پروتئولیتیک پودر آنزیم بروملین استفاده می شود.

ب. تجهیزات:

1. PH متر

2. حمام آب با دمای ثابت در 45.0 درجه ± 0.1 درجه

3. تراز تحلیلی

4. فلاسک های حجمی

5. پیپت های حجمی

6. تایمر

7. برت دیجیتال (دقت 0.1 میلی لیتر)

8. هود بخار

9. پیپترهای اتوماتیک

ج. اقدامات احتیاطی:

این آزمایش باید در هود بخار انجام شود.

1. از شیوه های استاندارد ایمنی آزمایشگاهی استفاده کنید.

2. فرمالدئید: همیشه آماده کنید و در هود بخور نگه دارید. سرطان زا و تراتوژن شناخته شده است.

3. پراکسید: اکسید کننده قوی

د. معرف ها و آماده سازی معرف:

1. آب مقطر: تقریباً 5{4}} 0 میلی لیتر: با 0.1 N HCI روی pH 4.5 تنظیم کنید.

2. بستر ژلاتینی:

آ. 25 گرم ژلاتین (Mikrobiologie. 1.04070) را در 375 میلی لیتر آب داغ حل کرده، بگذارید بجوشد. تا 45 درجه خنک شود.

ب pH را با 0.1 N HCI روی 4.5 تنظیم کنید و تا 500 میلی لیتر آب مقطر pH 4.5 رقیق کنید.

ج سطح ژلاتین را در دمای 45 درجه نگه دارید.

3. محلول بافر:

آ. 15 گرم نمک طعام را به آرامی به 40-50 میلی لیتر آب در یک بشر 150 میلی لیتری اضافه کنید و هم بزنید تا حل شود.

ب 570 میلی لیتر اسید استیک 0 اضافه کنید.

ج pH را با 0.2N HCL روی 4.5 تنظیم کنید (حجم بیشتر از 100 میلی لیتر خواهد بود.)

4. 3 درصد پراکسید هیدروژن:

آ. 2.5 میلی لیتر پراکسید هیدروژن 30 درصد (محلول ذخیره) را در یک فلاسک حجمی 25 میلی لیتری بریزید و با آب مقطر pH 4.5 به حجم رقیق کنید.

5. 37 درصد فرمالدئید pH 9.0: الف. حجم کافی (100 میلی‌لیتر) فرمالدئید را با pH 9.0 با NaOH 0.1 N تنظیم کنید (تقریباً 20 میلی لیتر فرمالدئید در هر نمونه قبل از تنظیم pH).

روش تحلیلی واحد هضم ژلاتین (GDU) - ادامه

6. 0.100 N NaOH: (استاندارد خریداری شده) a. محلول انبار: استاندارد شده در 0.100 نیوتن

E. رویه:

1. آماده سازی آنزیم:

آ. محاسبه آماده سازی آنزیم

وزن {{0}}/فعالیت هدف (تقریباً 0.05 گرم یا 50 میلی گرم)

الف. آنزیم را دقیقاً در بالن حجمی 50 میلی لیتر وزن کنید

ب- 8.3 میلی لیتر محلول بافر اضافه کنید.

ب بگذارید 30 دقیقه در دمای اتاق بماند.

ج. با استفاده از آب مقطر pH 4.5 تا 50 میلی لیتر رقیق کنید، یک نوار همزن کوچک اضافه کنید و 10 تا 15 دقیقه دیگر هم بزنید.

2. روش آنزیمی:

آ. 25 میلی‌لیتر از بستر ژلاتین را در هر یک از دو بشر 100 میلی‌لیتری حاوی میله‌های همزن بریزید و آنها را به مدت 5 دقیقه در حمام آب در دمای 45 درجه قرار دهید، یکی برای محلول آزمایش و دیگری برای محلول خالی.

ب راه حل تست:

1) 1.0 میلی‌لیتر محلول پودر آنزیم بروملین را به لیوانی که برای محلول آزمایشی تعیین شده است اضافه کنید، زمان‌بندی را شروع کرده و بچرخانید.

2) دقیقاً پس از 2{3}} دقیقه انکوباسیون در دمای 45 درجه، 0.1 میلی‌لیتر پراکسید هیدروژن 3 درصد اضافه کنید و بچرخانید.

3) به مدت 5 دقیقه دیگر جوجه کشی کنید.

4) لیوان را از حمام آب خارج کرده و با هم زدن مداوم پروب pH را وارد کنید.

5) pH را پس از 10 ثانیه ثبت کنید (PH اولیه)

6) pH را روی 6 تنظیم کنید.0 با 0.1 N NaOH. (تقریبا 2-4 میلی لیتر)

*توجه: هنگام تنظیم pH روی 6.{1}} در pH 5.8 محتاط باشید. pH به آرامی افزایش می یابد و افزودن دقیقه ای NaOH در این نقطه به طور قابل توجهی pH را افزایش می دهد.

7) با ادامه هم زدن، 10 میلی لیتر فرمالدئید 37 درصد pH 9.0 اضافه کنید.

8) pH را پس از 10 ثانیه و 1 دقیقه ثبت کنید.

9) تا pH 9.{2}} با 0.1 N NaOH تیتر کنید.

10) حجم تیتراسیون را ضبط کنید.

این تیتر آزمون، T. c.

محلول خالی: محلول خالی باید همزمان با محلول تست اجرا شود. این کار با شروع تعیین محلول خالی 12 دقیقه پس از شروع حل آزمایش انجام می شود. این به شما زمان می‌دهد تا قبل از ادامه کار با محلول خالی، آزمایش روی محلول آزمایشی را کامل کنید. 1) 0.1 میلی‌لیتر پراکسید هیدروژن 3 درصد را به لیوانی که برای محلول خالی تعیین شده است اضافه کنید و بچرخانید.

2) دقیقاً بعد از 20 دقیقه انکوباسیون در دمای 45 درجه 1.0 میلی لیتر محلول بروملین اضافه کنید و بچرخانید.

3) به مدت 5 دقیقه دیگر جوجه کشی کنید.

روش تحلیلی واحد هضم ژلاتین (GDU) - ادامه

4) لیوان را از حمام آب خارج کرده و با هم زدن مداوم پروب pH را وارد کنید.

5) pH را پس از 10 ثانیه ثبت کنید (PH اولیه)

6) pH را روی 6 تنظیم کنید.0 با 0.1 N NaOH. (تقریباً 2-4 میلی لیتر)*به یادداشت بالا مراجعه کنید.

7) با ادامه هم زدن، 10 میلی لیتر فرمالدئید 37 درصد pH 9.0 اضافه کنید.

8) pH را پس از 10 ثانیه و 1 دقیقه ثبت کنید.

9) تا pH 9.{2}} با 0.1 N NaOH تیتر کنید.

10) حجم تیتراسیون را ضبط کنید. این تیتر خالی، B است.

F. محاسبه:

1. تعریف: یک واحد هضم ژلاتین مقدار آنزیمی است که پس از 20 دقیقه هضم در دمای 45 درجه، 1 میلی گرم آمینو نیتروژن را از محلول استاندارد ژلاتین در pH 4.5 یا pH 5.5 (GDU pH 4.5 یا pH 5.5) آزاد می کند.

GDU/g {{0}} (TB) x 14 x N x 50 Wt (g) Where: T=تیتر آزمایش (ml 0.1 N NaOH) B=تیتر خالی (ml 0.1 N NaOH) N=نرمال بودن NaOH استاندارد شده (یعنی 0.100) Wt (g)=وزن اولیه آنزیم

ز. پارامترهای تست:

1. آماده‌سازی‌های آنزیمی تا غلظت تقریباً 0}.001 گرم در میلی‌لیتر (1 mg/ml) یا برای کنسانتره پودر آنزیم بروملین تقریباً 1-2 GDU/ml رقیق می‌شوند. برای اطمینان از صحت روش، یک ماده مرجع با هر اجرا مورد سنجش قرار می گیرد.

Guanjie پودر بروملین حجیم را با استفاده از روش آزمایش GDU ارائه می‌کند. فرآیند تولید ما تحت کارگاه‌های استاندارد CGMP، با استفاده از سه خط تولید در دو کارخانه و دو آزمایشگاه مستقل عمل می‌کند. برای هر گونه سوال در مورد محصولات ما، لطفا با ما تماس بگیریدinfo@gybiotech.com.